Phổ nmr là gì? Các bài báo nghiên cứu khoa học liên quan

Khái niệm về phổ NMR

Phổ NMR dựa trên hiện tượng một số hạt nhân có spin và mômen từ. Khi có mặt trong một từ trường đủ mạnh, các hạt nhân này định hướng theo hai trạng thái năng lượng khác nhau. Việc chiếu sóng vô tuyến ở tần số phù hợp làm các hạt nhân chuyển trạng thái và tạo tín hiệu có thể thu nhận. Cường độ và vị trí của tín hiệu mang thông tin về cấu trúc phân tử. Tín hiệu của NMR xuất hiện trong vùng radio nên mẫu không bị phá hủy. Điều này cho phép phân tích các hệ nhạy cảm như hợp chất tự nhiên hoặc phân tử sinh học.

Kỹ thuật này giúp mô tả môi trường hóa học quanh từng hạt nhân trong phân tử. Sự khác biệt trong mật độ electron, liên kết, hiệu ứng cảm hóa và hiệu ứng lập thể khiến các hạt nhân cùng loại cộng hưởng ở vị trí khác nhau. Nhờ đó phổ NMR trở thành công cụ nhận diện cấu trúc tinh vi. Trong nghiên cứu hữu cơ, NMR thường là bước cuối để xác định phân tử mới.

Các hạt nhân được sử dụng phổ biến gồm ¹H và ¹³C. Ngoài ra một số hạt nhân khác như ¹⁹F hay ³¹P dùng trong những trường hợp đặc thù. Bảng dưới minh họa một số hạt nhân thường gặp cùng tần số cộng hưởng tham chiếu.

Hạt nhân	Ưu điểm	Ghi chú
1H	Độ nhạy cao	Dễ thu phổ, phổ chuyên dụng nhiều
13C	Phạm vi tín hiệu rộng	Cần thời gian thu dài hơn
31P	Phân tích hợp chất phospho	Dễ tách tín hiệu do ít nhiễu nền

Nguyên lý vật lý cơ bản

Trong từ trường ngoài, các hạt nhân có spin tương tác với trường và trải qua sự tách mức năng lượng. Khi hấp thụ sóng vô tuyến ở đúng tần số Larmor, hạt nhân nhảy lên mức năng lượng cao hơn. Năng lượng này sau đó được giải phóng tạo ra tín hiệu đặc trưng. Tần số Larmor được mô tả bởi công thức:

$\omega_0 = \gamma B_0$

Trong công thức này, B₀ là độ mạnh của từ trường nam châm. Khi B₀ tăng, độ phân giải của phổ nâng lên vì các tín hiệu cách xa nhau hơn. Một máy NMR hiện đại thường có từ trường tương đương 400 đến 1200 MHz cho proton.

Các hạt nhân khác nhau có giá trị gamma khác nhau khiến chúng cộng hưởng ở các tần số khác nhau. Điều này cho phép ghép nhiều kỹ thuật đo trong cùng hệ thống. Tính toán năng lượng chuyển mức dựa trên các tham số spin cho phép ước đoán cường độ tín hiệu và các hiệu ứng phụ trong phổ.

Dữ liệu NMR ban đầu là tín hiệu thời gian gọi là FID. Tín hiệu này được biến đổi Fourier để chuyển sang dạng phổ tần số. Quy trình xử lý tín hiệu bao gồm lọc nhiễu, điều chỉnh đường nền và chuẩn hóa tích phân.

Hiện tượng dịch chuyển hóa học

Dịch chuyển hóa học thể hiện mức độ che chắn mà môi trường electron tạo ra cho hạt nhân. Electron bao quanh hạt nhân tạo dòng cảm ứng khi gặp từ trường ngoài. Dòng này làm thay đổi từ trường cục bộ mà hạt nhân cảm nhận, khiến tín hiệu lệch khỏi vị trí lý thuyết. Giá trị dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào bản chất hóa học của nhóm chức, hiệu ứng liên kết và tính thơm.

Dịch chuyển hóa học được biểu diễn theo đơn vị ppm với công thức:

$\delta = \frac{\nu - \nu_{ref}}{\nu_{ref}} \times 10^6$

Trong đó ν là tần số của tín hiệu cần xét và ν_ref là tần số của chất chuẩn. Khi đọc phổ, người dùng nhận diện các nhóm chức bằng cách so sánh vị trí tín hiệu với vùng điển hình. Ví dụ proton gắn vào nhân thơm thường nằm từ 6.5 đến 8 ppm, còn proton ankan thường nằm trong vùng 0.8 đến 1.5 ppm.

Một số yếu tố làm thay đổi dịch chuyển hóa học:

• Hiệu ứng rút electron hoặc đẩy electron
• Hiệu ứng vòng thơm tạo vùng khử che chắn và tăng dịch chuyển
• Liên kết hydro làm tín hiệu dời về vùng trường yếu

Tương tác ghép spin

Tương tác ghép spin xảy ra khi các hạt nhân liên kết gần nhau ảnh hưởng từ trường lên nhau. Điều này dẫn đến sự tách vạch trong phổ và hình thành các bội như doublet, triplet hoặc quartet. Khoảng tách giữa các vạch gọi là hằng số J và được đo bằng Hz. Hằng số này phản ánh số liên kết truyền tương tác và góc liên kết giữa các hạt nhân.

Trong phân tích cấu trúc, việc quan sát bội giúp xác định số proton lân cận. Quy tắc n+1 cho proton đơn giản cho phép dự đoán kiểu bội dựa trên số proton lân cận không tương đương. Ví dụ một proton kề hai proton khác sẽ cho tín hiệu dạng triplet.

Một số kiểu ghép thường gặp:

1. Ghép qua liên kết sigma với cường độ mạnh
2. Ghép qua hai hoặc ba liên kết tạo thông tin về khung carbon
3. Ghép dài hơn trong một số hệ có liên hợp hoặc vòng thơm

Phổ 1D và 2D

Phổ 1D là dạng phổ cơ bản nhất trong NMR. Các kỹ thuật phổ biến gồm ¹H NMR và ¹³C NMR. Trong 1D, mỗi tín hiệu được biểu diễn dưới dạng một chiều theo trục dịch chuyển hóa học. Người phân tích đọc vị trí, cường độ và dạng bội để suy luận cấu trúc. Thời gian thu phổ 1D ngắn, đủ cho phần lớn ứng dụng định tính và định lượng trong hóa hữu cơ, công nghiệp dược và kiểm tra độ tinh khiết vật liệu. Phổ 1D thích hợp xử lý mẫu có kích thước nhỏ, lượng chất giới hạn hoặc cần tốc độ phân tích nhanh.

Ngoài nền tảng 1D, các kỹ thuật 2D mở rộng khả năng truy vết tương quan giữa các hạt nhân. Trong phổ 2D, tín hiệu được hiển thị trên hai trục khác nhau, giúp xác định mối liên hệ trong không gian hoặc qua liên kết. Kỹ thuật COSY thể hiện tương quan proton-proton. HSQC và HMQC hiển thị tương quan một liên kết giữa proton và carbon. HMBC cung cấp tương quan qua hai đến ba liên kết, rất hữu ích để dựng bộ khung carbon hoàn chỉnh. Việc kết hợp các phổ 2D tạo bộ dữ liệu giàu thông tin, phù hợp cho phân tích cấu trúc phức tạp.

Một số kỹ thuật 2D thường gặp:

• COSY dùng cho proton gần nhau về mặt không gian hoặc liên kết
• HSQC cho proton liên kết trực tiếp với carbon
• HMBC cho tương quan dài hơn giữa proton và carbon
• NOESY và ROESY giúp xác định tương tác không gian

Ứng dụng trong hóa học và sinh học

NMR phục vụ nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau nhờ khả năng thu tín hiệu chi tiết và không phá hủy mẫu. Trong hóa hữu cơ, NMR là công cụ căn bản để xác nhận cấu trúc hợp chất mới, đánh giá độ tinh khiết và theo dõi phản ứng tổng hợp. Trong hóa học vật liệu, NMR rắn giúp khảo sát cấu trúc vật liệu nano, polymer và gốm. Việc đo động học phân tử qua thời gian thư giãn T1, T2 giúp đánh giá chuyển động cục bộ và tính linh động trong hệ polymer hoặc phức tăng trưởng tinh thể.

NMR còn đóng vai trò lớn trong sinh học phân tử. Nhiều protein khó kết tinh hoặc không phù hợp với tinh thể học tia X có thể được xác định cấu trúc bằng NMR dung dịch. Kỹ thuật đánh dấu đồng vị ¹⁵N hoặc ¹³C cho phép lập phổ 2D và 3D để xây dựng mô hình protein. NMR phục vụ nghiên cứu liên kết ligand protein, khảo sát vùng hoạt động enzyme và theo dõi thay đổi cấu trúc khi điều kiện môi trường thay đổi. Phương pháp này cũng được dùng để sàng lọc thuốc thông qua theo dõi sự dịch chuyển tín hiệu khi ligand liên kết vào vị trí hoạt động.

Bảng dưới liệt kê một số ứng dụng tiêu biểu của NMR trong các lĩnh vực khác nhau.

Lĩnh vực	Ứng dụng chính	Ghi chú
Hóa hữu cơ	Xác định cấu trúc	Phổ 1D kết hợp 2D
Sinh học phân tử	Khảo sát protein	Cần đánh dấu đồng vị
Vật liệu	Đánh giá động học	NMR rắn và MAS

Dụng cụ và chuẩn phân tích

Máy NMR gồm ba bộ phận chính: nam châm siêu dẫn, bộ phát và thu sóng RF, hệ thống đầu dò cùng phần mềm xử lý. Trong đó, nam châm siêu dẫn giữ vai trò tạo từ trường mạnh và ổn định. Từ trường càng mạnh thì độ phân giải phổ càng cao. Tần số máy thường được gọi theo tần số cộng hưởng của proton, ví dụ máy 400 MHz, 500 MHz hoặc 800 MHz. Sự khác biệt này ảnh hưởng trực tiếp đến độ nhạy và độ tách tín hiệu.

Đầu dò (probe) là thành phần quan trọng để thu nhận tín hiệu. Probe hiện đại có khả năng làm lạnh để giảm nhiễu và tăng độ nhạy. Một số probe đa nhân cho phép đo nhiều loại hạt nhân trong cùng một hệ thống. Dung môi khử từ thường dùng gồm CDCl₃, DMSO-d₆, hoặc methanol-d₄. Dấu khóa tần số (lock) giúp ổn định tín hiệu khi có thay đổi nhỏ trong từ trường.

Chất chuẩn thường là TMS trong ¹H và ¹³C NMR. Với các dung môi không chứa TMS, dung môi khử từ sẽ có tín hiệu đặc trưng dùng để tham chiếu. Việc lựa chọn chuẩn ảnh hưởng đến độ chính xác của dịch chuyển hóa học và sự thống nhất giữa các phòng thí nghiệm.

Quy trình thu phổ và xử lý dữ liệu

Quy trình bắt đầu bằng chuẩn bị mẫu. Mẫu phải được hòa tan trong dung môi khử từ phù hợp. Lượng mẫu cần thiết phụ thuộc độ nhạy của máy và yêu cầu tín hiệu. Sau khi đưa mẫu vào máy, bước shim được thực hiện để cải thiện độ đồng nhất từ trường. Shim tốt giúp tín hiệu sắc nét và giảm độ rộng vạch.

Khi bắt đầu thu phổ, máy phát ra các xung RF để kích thích hạt nhân. Dữ liệu thu được dưới dạng tín hiệu thời gian FID. FID chứa nhiều nhiễu nên cần các bước xử lý như apodization, zero filling và cân chỉnh đường nền. Sau khi biến đổi Fourier, phổ hiển thị dạng trục tần số. Người dùng có thể tích phân tín hiệu để xác định tỷ lệ hạt nhân hoặc khử nhiễu để tăng độ rõ của peak.

Phần mềm chuyên dụng như MestReNova hoặc Bruker TopSpin cung cấp nhiều công cụ để phân tích nâng cao. Các chức năng bao gồm tách chồng tín hiệu, khớp mô hình bội, chỉnh pha tự động hoặc thủ công và xây dựng tương quan trong các phổ 2D. Dữ liệu cuối cùng có thể xuất ra các định dạng chuẩn phục vụ xuất bản khoa học.

Giới hạn và yếu tố ảnh hưởng

Mặc dù NMR là kỹ thuật mạnh, nó vẫn có những giới hạn. Độ nhạy là một trong những trở ngại chính. Các hạt nhân có độ phong phú tự nhiên thấp như ¹³C cho tín hiệu yếu, đòi hỏi thời gian thu kéo dài. Một số mẫu có độ nhớt cao hoặc trạng thái đa pha gây khó khăn trong việc shim và làm tín hiệu bị dãn rộng.

Hiệu ứng giãn nở T₁ và T₂ ảnh hưởng trực tiếp đến độ sắc nét của tín hiệu. T₂ ngắn làm peak rộng và giảm khả năng phân giải. Các yếu tố như nhiệt độ, nồng độ mẫu, tạp chất paramagnetic cũng góp phần làm suy giảm tín hiệu. Sự lựa chọn dung môi, tốc độ quay mẫu (đối với NMR rắn) và độ ổn định của từ trường là những yếu tố then chốt cần tối ưu.

Một số biện pháp cải thiện tín hiệu:

• Dùng probe lạnh để tăng tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu
• Tăng số lượng quét để cải thiện độ nhạy
• Điều chỉnh nhiệt độ để tối ưu T₁ và T₂
• Sử dụng phương pháp khuếch đại tín hiệu như DNP trong nghiên cứu nâng cao

Tài liệu tham khảo

• American Chemical Society ChemMatters. Introduction to NMR.
• Nature Scitable. Definition of Nuclear Magnetic Resonance.
• MGH NMR Center. What is NMR?
• PubChem. Chemical data and spectral references.
• NIST. NMR Spectroscopy Program.